产品目录

DAF-FM DA新一代一氧化氮(NO)检测探针，与以往的一氧化氮荧光检测探针DAF-2 DA相比较，主要有以下优势：一是DAF-FM DA和NO反应形成的荧光产物在pH5.5以上不受pH影响；二是反应产物荧光更加稳定，不容易淬灭，更加便于检测；三是DAF-FM DA的最低检测浓度可达到3nM，与DAF-2 DA相比最低检测浓度提高近2倍。

英文名字	4-Amino-5-Methylamino-2,7-Difluorofluorescein Diacetate
CAS号	254109-22-3
分子式	C25H18F2N2O7
结构式
浓度	5mM in DMSO
外观	淡黄色溶液

• BSA和酚红对该荧光探针的检测有干扰，需避免；
  
• 第一次使用前请将本品分装并于-20℃冻存，避免反复冻存；荧光探针工作液需立刻使用，不能长时间保存。
  
• DAF-FM DA在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20～25℃温浴片刻至全部溶解后使用。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 装载探针
  对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用适当的阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
  
  • 原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000比例，用本试剂盒提供的探针稀释液稀释DAF-FM DA，使终浓度为5μM。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DAF-FM DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DAF-FM DA的体积为1mL。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。
    
  • 收集细胞后装载探针：按照1:1000比例，用本试剂盒提供的探针稀释液稀释DAF-FM DA，使终浓度为5μM。细胞收集后，用稀释好的DAF-FM DA重悬细胞，细胞浓度为1×10⁶～2×10⁷cell/mL，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。上述操作可以在离心管内进行。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。直接用适当的阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后再刺激细胞。
• 检测
  对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察(用普通的荧光显微镜观察效果相对较差)，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
  
• 参数设置
  使用495nm激发波长，515nm发射波长，实时、逐时间点或单时间点检测刺激前后荧光的强弱。DAF-FM和一氧化氮反应产物的荧光光谱和fluorescein非常相似，可以用检测fluorescein的参数设置进行检测，用检测FITC的参数设置进行检测也可以。
  
• 其它说明
  上述推荐的DAF-FM DA的工作浓度为5μM，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000的比例稀释DAF-FM DA，使装载探针时DAF-FM DA的浓度为1～2.5μM。相反，如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可以把DAF-FM DA的工作浓度为调整为10μM，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。